产品目录

细胞核蛋白、细胞浆蛋白在细胞研究和蛋白质组学中具有重要意义，因此在体外研究中需要将其从细胞或组织中分离。本试剂盒提供了一种较为简单方便，高效的蛋白抽提方法，其原理是：通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂C抽提得到细胞核蛋白。

• 客户需自备PMSF。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 细胞样品蛋白的抽提
  
  • 细胞处理
    
    • 对于贴壁细胞：PBS清洗细胞1次，EDTA溶液消化细胞或用细胞刮子刮下细胞，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
      注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解抽提的目的蛋白。
      
    • 对于悬浮细胞：离心收集细胞，PBS清洗细胞1次，收集细胞，尽量吸尽上清，留细胞沉淀备用。
  • 每20μL细胞沉淀加入200μL含PMSF的试剂A。
    注：对于2×10⁶个Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20μL或40mg。
    
  • 最高速剧烈涡旋5s，完全悬浮分散细胞沉淀。
    注：如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长旋涡震荡的时间。
    
  • 冰浴10～15min。
    
  • 加入胞浆蛋白抽提试剂B（以下统称：试剂B）10μL。最高速剧烈涡旋5 s，冰浴1min。
    
  • 最高速剧涡旋5 s，4℃ 12000～16000g离心5min。
    
  • 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，上清即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存备用。
    注：此步千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免吸到沉淀。
    
  • 对于沉淀，完全吸尽残余上清，加入50μL含PMSF的试剂C。
    注：此步需完全吸尽上清，否则会带来细胞浆蛋白的污染。
    
  • 最高速剧烈涡旋15-30 s，把沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1～2min再高速剧烈涡旋15-30 s，共30min。
    
  • 4℃ 12000～16000g离心10min。
    
  • 立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存备用。
• 组织样品的抽提
  
  • 将组织切成非常细小的碎片。根据后续使用量按照20:1的比例混合试剂A和B，并加入PMSF至最终浓度为1mM，混匀即可配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200μL组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。
    注：匀浆需在冰浴或4℃进行。
    
  • 匀浆后将匀浆液转移至塑料离心管内，冰浴放置15min。
    
  • 4℃ 1500g离心5min。把上清转移至一预冷的塑料管中，上清含部分细胞浆蛋白。
    注：吸上清时千万不要触及沉淀。
    
  • 对于上述收集得到的沉淀，已经充分匀浆，但很多细胞仍没有破碎。接下来请参照【细胞样品蛋白抽提】的步骤2）开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，即可得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤【组织样品抽提】中步骤3）抽提得到的细胞浆蛋白合并备用。